Globalement, le jeu narre l'histoire d'Altaïr, un assassin, dans les années 1200.
Le scénario dans le détail est plus complexe. Le joueur dirige Desmond Miles, au XXIe siècle, un jeune homme capturé par Abstergo, une organisation qui veut mettre la main sur un puissant artefact. Lucy et Vidic, deux scientifiques, s'occupent de Desmond, et le forcent à entrer dans une mystérieuse machine moderne, l'animus. Cette machine permet de revivre les évênements vécus par ses ancêtres. L'ancêtre de Desmond Miles intéressant les scientifiques est Altaïr Ibn La-Ahad, un maître assassin de la fraternité des assassins à la fin du XIIe siècle.
Son histoire se déroule en l'an 1191, lors de la Troisième croisade dans l'esprit de l'Ordre du Temple. « Al-tair » en arabe signifie « le volant » et « Ibn La-Ahad » signifie « sans parents, littéralement "fils de personne" », le personnage agissant comme un oiseau de proie pendant les assassinats. Altaïr est aussi l'étoile la plus brillante de la constellation de l'Aigle, ce qui peut amener à comparer Altaïr à un aigle perché attendant le moment propice pour fondre sur sa proie. Ce jeune homme désapprouve les décisions des hautes autorités ecclésiastiques usant un peu trop souvent de la potence. Altaïr assassine des personnages importants dans le but de ramener la paix dans sa patrie natale, c'est du moins ainsi qu'il voit les enseignements et les missions donnés par son mentor. Comme le titre du jeu l'indique, Altaïr est un assassin agissant en représailles de ces exécutions arbitraires. Le mot « assassin » n'est donc pas ici péjoratif.